基于光源调制技术的金标试纸条定量分析仪器

摘  要： 基于光电检测原理，研发了一套可用于金标免疫试纸条定量检测的分析仪器。采用绿光发光二极管（LED）作为发射光源，以光电二极管接收试纸条反射光，并通过步进电机带动检测系统扫描试纸条待检区域。系统采用光源信号的调制与接收信号的解调技术，以消除环境干扰噪声。实验结果表明，该仪器检测结果准确，与真实值之间误差<1%；稳定性高，变异系数CV<2%。
关键词： 光电检测；金标免疫试纸条；定量；调制；解调

    金标免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析技术等多种技术结合在一起的固相标记免疫技术，因其操作简便、快速，且具有很高的异性和敏感性，已广泛应用于人绒毛膜促性腺激素（HCG）、鼠疫、乙肝、寄生虫、艾滋病等临床检测中[1]。金标免疫试纸条检测目前主要停留在定性判断，应用范围受到很大限制。定性判断容易受人为因素的干扰，且灵敏度低，可能出现“假阳性”与“假阴性”，而且在临床上不能建立该待检指标的动态过程[2-3]。因此，研究试纸条的定量测试仪器具有重要意义。
    国内外学者对胶体金试纸条的定量测试进行了一系列研究，光电检测技术是普遍采用的检测方案，但是信号的接收部分存在多种设计方案，各有优弊。采用光敏电阻测量方案，电路简单、测量光强范围广，但是光敏电阻在测量中存在严重的阻值漂移，影响测量精度；采用CCD、CMOS等图像传感器测量显色区域，虽然避免了设计机械扫描机构，但是后期对图像的分析处理同样复杂，而且这种方案成本较高，难以在市场上推广。本文设计的仪器采用绿光LED作为发射光源，以光电二极管接收试纸条反射光，并通过步进电机带动检测系统扫描试纸条待检区域，从而快速、准确读取胶体金试纸条检测结果。但由于检测系统不可能处于完全黑暗的环境，必然会受到环境的噪声干扰。对此，本仪器还通过控制光源信号的调制及接收信号的解调过程，使光电传感器只对特定频率光信号敏感，从而消除了光谱的背景光及环境电磁干扰，提高了仪器系统检测精度。
1 金标免疫试纸条定量检测原理
    金标免疫层析技术原理是：将特异性抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当干燥的硝酸纤维素膜一端滴入样品（可取血、尿、唾液）后，由于渗透作用，样品沿着纤维膜移动，当移动到固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，发生显色。纤维素膜上一般有两条线：检测线（简称T线）和对照线（简称C线）。结果判定：如果检测线和对照线均显色，则为阳性，表明样品中含有待检物；如果仅对照线上显色而检测线未显色，则为阴性结果，即未检测到目标物质；如果对照线上未显色，则无论检测线上是否显色，都认为此次检测失败。如果样品中含有待检物，则检测线会显色，而且样品中目标待测物的含量越高，显色会越深[1，4]。
    根据吸光度原理，物体颜色的深浅和光的吸收与反射有关。颜色越深，则对光的吸收越强，反射的光强就越弱。因此，目标待测物的浓度和检测带的反射光强呈负相关关系。在待检物一定浓度内，可认为反射光强与其浓度成线性关系。基于以上原理，通过适当的光电检测方法测量出反射光强，就可计算出目标待测物的浓度[3-5]。
2 系统设计
    金标免疫试纸条分析仪主要由机械扫描模块、光路模块、电路控制模块、输入输出模块组成，如图1所示。电路控制模块控制LED光源发出中频光信号照射到试纸条上，然后驱动步进电机移动，以带动机械扫描模块移动。光电二极管接收扫描得到的试纸条上反射的光信号并将其转换成电信号后送入电路控制模块进行处理。该系统外扩微型打印机、LCD、SD卡等输出设备，处理后得到的检测结果可被即时打印出来或者由LCD显示，也可存储到SD卡，供后期海量数据的分析、比对使用。

2.1 系统光路设计及机械结构
    金标免疫试纸条上显色物质为纳米金颗粒，其聚集形成暗红色条带，对绿光的吸收最强烈。为了增加光强，本系统中对称安装一对高稳定性的强光绿色LED作为照明光源，其波长约为520 nm，接收部分使用高灵敏度的光电二极管。光路模块结构如图2所示，扫描系统机械图如图3所示。

    从图2和图3可以看出，LED光源和光电二极管组成光路系统。光路系统固定在封闭暗箱内，并可以随步进电机沿着导轨滑动，实现对试纸条检测区域的扫描。扫描一次的步程为11.5 mm，时间为8 s。
2.2 系统电路设计
    电路设计是本系统设计的重点。对试纸条的扫描检测不可能在完全封闭、不透光的环境中进行，因此，光电传感器接收的反射光信号中必然混杂着环境光线等一系列噪声信号的干扰。如何从强干扰噪声中提取出有效反射光信号是本次设计中的关键技术。
    干扰噪声和有效反射光信号在测量中一直混杂着，很难从时域上区分，故考虑从频域上去噪。干扰噪声处于低频段，而系统需要采集的反射光信号是与光源一致(即可调)的。所以可将绿光LED光源调制到中频段，即可产生中频段的反射光信号，再通过滤波、解调即可得到去除噪声的有效光电信号[6]。
    如图4所示，使用交流调制驱动LED，使LED发出的绿光处于2 kHz的中频波段。试纸条反射的光信号通过光电二极管接收后转为电流信号，电流信号通过精密I/V转换电路后变成电压信号。此电压信号经过带通滤波后，实现与干扰噪声的分离，然后进行放大，得到交流待检信号Signal_AC。Signal_AC 的幅值表征反射光的光强，但此信号无法直接送入A/D转换器得到幅值，还需要恰当的检波电路实现信号解调，经过检波电路后的信号如图4中Signal_AD。系统采用的A/D转换器具有数字低通滤波器的功能，相当于将信号积分平均处理。如此，Signal_AD最终转化成直流信号，再进行采样送入单片机处理。

3 实验结果及分析
    实验样品如图5所示，每张试纸条中有两条红线，其中上面一条颜色较深，为C线，起对照作用；下面一条颜色较浅的为T线，T线颜色深浅即表征样品的浓度大小。配置T/C深浅比值分别为100%、50%、30%、10%、5%的5个试纸条进行扫描测试。

    扫描检测的结果如图6所示。每条试纸条扫描后的波形有两个波谷，表征两条色带对光源的两个吸收峰。为了准确获取曲线上的T值、C值，采用面积积分法，即分别求取两个波谷面积T_Area、C_Area，然后求取波谷相对面积比T/C。从图中可以看出，5份样品中对照线、检测线均被检出，检测结果分别为100%、49.2%、29.6%、10.6%、4.5%。每份样品检出值与实际值误差均小于1%。对2号、5号样品分别扫描检测10次，结果如图7所示。2号样品均值为4.49%，变异系数为1.15%；5号样品均值为49.5%，变异系数为0.5%。可见，该系统检测结果稳定性很高，变异系数小于2%。

    基于光电检测技术成功研制了一套金标免疫试条分析仪。系统通过对光源信号的调制及对接收信号的解调技术，成功去除了干扰噪声，提高了仪器检测精度。使用标准金标试纸条进行实验，检测结果与实际值非常接近，误差小于1%；样品的重复性实验变异系数均低于2%，表明该仪器测量结果稳定性高，抗干扰能力强。本仪器在金标试纸条的快速、定量检测中有广阔的应用前景。
参考文献
[1] KIM S，PARK J K.Development of a test strip reader for a lateral flow membrane-based immunochromatographic assay[J].Biotechnology and Bioprocess Engineering，2004(9)：127-131.
[2] Qiu Xianbo，Liu Changchun，MICHAEL G.A portable analyzer for pouch-actuated,immunoassay cassettes[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2011，160(1)：1529-1535.
[3] 黄立华，曾爱军，张友宝，等.金标免疫试纸条反射式光度计的研制[J].仪器仪表学报，2009，30(3)：663-667.
[4] 杜民.基于光电检测与信息处理技术的纳米金免疫层析试条定量测试的研究[D].福州：福州大学，2005.
[5] 张友全，杨成文，陈峰，等.一种新型便携式甲霜灵胶体金试纸条显色分析仪的研制[J].仪器仪表学报，2009，30(10)：2175-2179.
[6] 潘轶，叶树明，杨俊毅，等.基于伪随机序列调制的荧光测量系统[J].仪器仪表学报，2011，32(7)：1470-1477.